IHC罕见题目缘故原由剖析

无染色

一抗和二抗不婚配

利用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

没有充足的一抗与目的卵白联合

利用低浓缩度抗体。延伸4℃孵育工夫（如留宿）。

抗体的自然布局（3D形状）受损不实用于IHC

用自然（非变性的）WB法检测抗体，确保抗体没被破坏。

由于不妥贮存、浓缩或重复冻融形成一抗/二抗试剂盒生效

做阳性比较确认一抗/二抗试剂盒的无效性。

靶构造中没有目的卵白

参照抗体供给商的发起做阳性比较。

构造中没有充足的目的卵白

使用信号缩小操纵。

没有避光保管二抗

制止将二抗处于光照下

脱蜡不彻底

延伸脱蜡工夫，改换二甲苯。

牢固步调（利用福尔马林和多聚甲醛牢固剂）修饰了抗体辨认表位

抗原修复法表露出抗原表位，延长牢固工夫。

卵白位于细胞核内（核卵白），抗体不克不及穿透核膜

在关闭液和抗体浓缩液中参加通透剂。

PBS缓冲液被细菌净化后毁坏了靶卵白的磷酸根

在抗体PBS贮存液中参加0.01%叠氮化合物，或利用奇怪无菌的PBS。

高配景

没有关闭非特异性联合或关闭不充实

延伸关闭工夫，并思索更换关闭剂。发起用10%正常血清关闭切片1小时或1-5% BSA关闭培育细胞30分钟。

一抗浓渡过高

滴定法寻觅到最佳抗体浓度，或在浓度较低抗体中延伸孵育工夫（最好是迟缓而正确地联合）。

孵育温渡过高

4°C孵育切片或细胞。

二抗产生了非特异性联合（被破坏）

不加一抗，做二抗比较。

构造冲洗不彻底，有牢固剂残留

一切步调都要用PBS充实洗濯。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶克制剂如克制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM)，或克制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

牢固过分（牢固剂用福尔马林和多聚甲醛）招致抗体辨认抗原位点被修饰

改动抗原修复办法，延长与抗原修复液的孵育工夫。

信号过分缩小（信号缩小技能）

延长信号缩小孵育工夫，浓缩信号扩展试剂盒。

染料与PBS在细胞/构造中互相作用（酶检测法）

用Tris缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。孵育后，Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

通透作用毁坏膜并撤除了膜卵白

去除缓冲液中的通透剂

底物过量（酶检测法）

延长底物孵育工夫

非特异性染色

一抗/二抗浓渡过高

低落抗体浓度和或延长孵育周期。比拟不表达目的卵白细胞的信号强度。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶克制剂如克制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM)，或克制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

一抗与被染构造同源(如用鼠一抗测鼠构造)，加二抗后，二抗会与同源的一切构造联合

使用与构造非同源的一抗

切片/细胞变干

坚持切片/细胞湿度，切勿变干。