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细胞增殖与毒性检测实行办法及履历总结-CCK-8 法

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实行原理:Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于轻便而正确的细胞增殖和毒性剖析。其根本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶复原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产品(Formazan dye)。天生的甲瓒物的数目与活细胞的数目成反比。因而可使用这一特征间接举行细胞增殖和毒性剖析。

一、用处:

  药物挑选、

  细胞增殖测定、

  细胞毒性测定、

  肿瘤药敏实验等。

二、好处:

· 利用利便,省去了洗濯细胞,不必要放射性同位素和无机溶剂;

· CCK-8法能疾速检测;

· CCK-8法的检测敏捷度很高,乃至可以测定较低细胞密度;

· CCK-8法的反复性优于MTT 法,MTT 实行天生的formazan 不是水溶性的,必要利用DMSO 等无机溶剂消融; 而本办法发生的formazan 是水溶性的,不但省去了消融步调,更因而而增加了该操纵步调带来的偏差;

· CCK-8法对细胞毒性小,可以屡次测定选取最佳测定工夫,与MTT 办法相比线性范畴更宽,敏捷度更高;

· CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。

三、所需设置装备摆设及仪器:

1. 10ul,100-200ul及多通道移液器

2. 酶标仪(带有450nm滤光片)

3. 96孔培育板

4. 二氧化碳培育箱

四、办法及步调:

实行一:细胞增殖剖析

1、制备细胞悬液:细胞计数。

2、接种到96孔板中:依据符合的铺板细胞数(约1-2×104),每孔约100ul细胞悬液,异样的样本可做4-6个反复。

3、37℃培育箱中培育:细胞接种后贴壁约莫必要培育4小时,假如不必要贴壁,这步可以省去。

4、参加10ul CCK8:由于每孔参加CCK8量比力少,有大概因试剂沾在孔壁上而带来偏差,发起将枪头浸入培育液中参加且在加完试剂后悄悄敲击培育板以协助混匀。大概间接设置装备摆设含10%CCK8的培育基(现用现配),以换液的情势参加。

5、培育0.5-4小时:细胞品种差别,构成的Formazan的量也纷歧样。假如显色不敷的话,可以持续培育,以确认最佳条件(发起预实行先摸明白工夫点)。分外是血液细胞构成的Formazan很少,必要较长的显色工夫(5-6小时)。

6、测定450nm吸光度:发起接纳双波上进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

实行二:细胞毒性剖析

1、制备细胞悬液:细胞计数

2、接种到96孔板中:依据符合的铺板细胞数(约≥5×104),每孔约100ul细胞悬液,异样的样本可做4-6个反复。

3、37℃培育箱中培育:细胞接种后贴壁约莫必要培育4小时,假如不必要贴壁,这步可以省去。

4、参加差别浓度的毒性物质。

5、37℃培育箱中培育:参加毒性物质的培育工夫,要看毒性物质的性子和细胞的敏理性,一样平常要依据细胞周期来决议,最少要一代以上的工夫(比方:6、12、24、48、60、72小时)。

6、参加10ul CCK8:由于每孔参加CCK8量比力少,有大概因试剂沾在孔壁上而带来偏差,发起将枪头浸入培育液中参加且在加完试剂后悄悄敲击培育板以协助混匀。

7、培育0.5-4小时:细胞品种差别,构成的Formazan的量也纷歧样。假如显色不敷的话,可以持续培育,以确认最佳条件。分外是血液细胞构成的Formazan很少,必要较长的显色工夫(5-6小时)。

8、测定450nm吸光度:发起接纳双波上进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

五、实行留意事变:

●若临时意外定OD值,可以向每孔中参加10 μL 0.1M的HCL溶液大概1% w/v SDS溶液,并遮掩培育板避光保管在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会产生变革。

●假如待测物质有氧化性或复原性的话,可在加CCK8之前改换奇怪培育基(撤除培育基,并用培育基洗濯细胞两次,然后参加新的培育基),去失药物影响。固然药物影响比力小的状况下,可以不改换培育基,间接扣除培育基中参加药物后的空缺吸取即可。

●当利用尺度96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至多为1,000 个/孔 (100 μl 培育基)。检测白细胞时的敏捷度绝对较低,因而保举接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培育基)。

●酚红和血清对CCK8法的检测不会形成搅扰,可以经过扣除空缺孔中本底的吸光度而消去。

●CCK8可以检测大肠杆菌,但不克不及检测酵母细胞。在细胞增殖实行每次测定的历程中必要制止细菌净化,以免影响后果。

●CCK-8在0-5℃下可以保管至多6个月,在-20℃下避光可以保管1年。

●当在培育箱内培育时,培育板最外一圈的孔最容易枯燥挥发,由于体积禁绝确而增长偏差。一样平常状况下,最外一圈的孔加培育基大概PBS,不作为测定孔用。

●在培育基中参加CCK8,培育肯定的工夫,测定450 nm的吸光度即为空缺比较。在做加药实行时,还应思索药物的吸取,可在参加药物的培育基中参加CCK8,培育肯定的工夫,测定450 nm的吸光度作为空缺比较。

●金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会克制5%、15%、90%的显色反响,使敏捷度升级。假如终浓度是10 mM的话,将会100%克制。

●悬浮细胞由于染色比力难,一样平常必要增长细胞数目和延伸培育工夫。

●参加CCK-8 时,假如细胞培育工夫较长,培育基颜色或pH 值已变革,发起换用奇怪的培育基。

●用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,不然会搅扰测定,且要擦拭洁净样品板了。

六、履历总结及分享:

CCK8的阐明书各人肯定要仔细阅读,内里许多细节的题目都有提到。并且阐明书里提供的一些关于种种细胞的种板数都很有参考代价,由于那是重复验证过的最佳数值。但无论怎样,做这个实验肯定要摸条件。你就算再懒,这个懒不得,不然你都只是在做无勤奋。以下言论所有以细胞毒性实验为条件, 假如你做的是促进细胞生长的药物的药效实行那就另当别论了。

摸条件包罗1、种板数;2、种板后细胞的贴壁生永劫间;3、加药后的孵育工夫;4、cck8试剂参加量;5、cck8试剂参加后细胞孵育工夫。看起来许多,实在这便是一个实行。并且都是种的空缺板,也便是不加药物,只加细胞和CCK8。

1、种板数:这个要查文献,看你所用细胞他人有无做过,把范畴大抵找出。记着还要参考阐明书,这个很紧张。然后浓缩一系列浓度种板。起首你要察看多永劫间细胞可贴壁完全,一样平常贴壁生长24小时。然后另有在你的实行工夫内,差别细胞数下孔内生长状况。好比我制定观察4天的工夫,那么在4天内,细胞是恰好铺满照旧聚集生长?由于每块板都市设置比较孔,也便是含有细胞的培育基+CCK8,这个数值是板上的最大数值,CCK8实验最佳OD值在1.0左近,以是这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实行履历是不要让细胞长满,一旦长满了很难去判别能否聚集生长了,对药物可否顺遂进入细胞有影响此为其一,其二生长不匀称易招致孔间OD值数据偏向大,并且OD值也很大。

2、贴壁生长的工夫我一样平常就间接让它贴壁长24h了,这个工夫细胞曾经贴壁完全,并且如许设置工夫对本人布置实行工夫也利便。没人乐意泰半夜爬起来做实行吧。

3、加药后的孵育工夫,我的实行摸了3个工夫,24h,48h,72h。然后依据数据的波动性(RSD)、OD值的范畴(1.0左右)这些来选择最好的工夫。太长了就没有须要了,细胞呆在孔里几天不换液后果可想而知了。

4、CCK8试剂参加量,阐明书中明白写出发起参加量为培育基体积的10%。这里有一个题目:假定我要孔内是200微升的系统,即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢,照旧细胞悬液+药液=200微升,cck8不算在系统内呢。关于这一点文献报道纷歧致。自己终极接纳的是后者。

5、cck8试剂参加后孵育工夫,随着工夫的增长,OD值就会增大。总之准绳便是把OD值控制在1.0左右。这里我观察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置题目。众所周知四周一圈孔由于边沿效应都是不必来做实行的。一样平常每组样品我会设置6个复孔,失掉的OD值去失最大值与最小值,其他取均匀值。我用的是排枪,会省许多强度,但也会增大组内偏差。这个只要经过校正移液枪和选用最适枪头了。

做这个实行我想各人遇到的最大题目应该是数据不波动,组内数据偏向大。讲了许多怎样摸条件,实在就一个准绳,把OD值控制在1.0左右。数据不波动也只能经过增大样品数,借助数据处置来补偿。另有实行操纵肯定要细心警惕,只管即便平行操纵。

增补: 忽然想升引酶标仪检测的时分另有一些细节题目。好比孔里不克不及有气泡,假如有气泡,就用吸耳球吹失,气泡会很影响检测后果。样品板要擦拭洁净,固然了,盖子肯定要记得拿失啊Big Smile增补阐明:这几天有同砚提出了一个题目,这个题目十分好也十分要害:将OD值控制在1.0这个说法能否有根据?

这里我照旧想提示各人肯定要仔细阅读试剂盒的阐明书,试想一个试剂盒的上市而且作为妙技[miào jì]失掉承认必要颠末几多实验重复验证。我购置的是同仁化学研讨所的CCK8试剂盒,阐明书的P7Q23:OD值在什么范畴比力符合?答:一样平常状况下OD值在0.1-2.0都可以,在1.0左近比力好。

再说到本人的实行设计,酶标仪的原理实在和紫外分光光度计是一样的,以是UV上许多减小偏差的留意事变在酶标仪上异样受用。这就可以了解为什么不克不及有气泡,为什么要擦拭洁净样品板了。再者熟习UV原理的同砚会理解使用紫外检测有一个最佳检测范畴,凌驾了这个范畴,数值就会出现出不波动,无纪律。(各人可以把本人的数据统计剖析看看是不是数值控制在1.0左近更波动。)而更有甚者便是凌驾了仪器的检测范畴,仪器读数为—。我在摸条件的时分,cck8参加2.0h后检测就呈现过酶标仪读不出数据的状况。

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